模拟子宫的微流控芯片技术

辅助生殖技术的应用使得不育夫妇得以实现妊娠生子的愿望,由不育引发的相关问题也随之得到解决。体外受精-胚胎移植(In vitro fertilization-embryo transplantation, IVF-ET),即试管婴儿,是辅助生殖技术的重要内容。该技术是指将从母体取出的卵子体外受精并发育成前期胚胎后移植回母体子宫内,经妊娠后分娩婴儿。历经60 余年的发展,IVF-ET 已经得到广泛推广并成为治疗不孕症的主要手段。尽管IVF-ET 取得了巨大成功,该技术仍存在许多不足,其中最突出的问题包括妊娠率低、多胎妊娠发生率明显增高和出生后缺陷风险增高 。究其原因,主要是由于现有细胞培养技术不能有效模拟体内条件,因而影响了胚胎质量。因此,现实医疗工作中迫切需要一种能够模拟子宫环境,保证高质量受精和胚胎发育的细胞培养技术。微流控芯片是组织、器官仿真的有力工具。一方面,微流控通道具有与体内微血管相似的尺寸,在这个尺度下流体所具有的层流特性便于实现精确的流体控制;另一方面,通过芯片材料和芯片结构设计,可以有效模拟组织或器官的结构和功能。前期研究报导了一系列基于微流控芯片的精子分选、受精以及胚胎发育等单元操作技术提高胚胎质量。本工作设计了一种微流控芯片子宫,保证在类似子宫内部的环境下实现排卵、受精和胚胎发生。初步结果显示,芯片子宫较之传统细胞培养平台可以获得更高的桑椹胚率和囊胚率。

 

实验部分

 

芯片结构与加工

芯片包含3 层结构,顶层和底层为PDMS 而中间层为多孔PC 膜(图1a)。PDMS 层采用标准软刻蚀工艺加工。首先在平板玻璃上完成SU-8 模板的制作。取直径为3 英寸的玻璃置于浓H2SO4-H2O2(3：1, V / V)中煮沸30 min,取出后用蒸馏水冲洗3 次,并在蒸馏水中超声清洗2 次,每次30 min。超声后的玻璃用氮气吹干,备用。将洁净玻璃置于匀胶台,向其中心处滴加SU8 3025 光刻胶,匀胶机转速为600 r/ min,持续30 s,升高转速至1000 r/ min,再持续30 s。铺胶后的玻璃置于烘胶台上进行前烘,95 ℃烘15 min。待玻璃自然冷却后,用掩膜覆盖玻璃表面的SU-8 胶层,置于紫外光刻机下曝光20 s。曝光后立刻将玻璃置于烘胶台上95 ℃烘15 min。待玻璃自然冷却后将其置于显影液中,轻轻震荡进行显影,之后用电吹风将其吹干。最后,将模板置于175 ℃烘箱中烘1 h,进行坚模以得到SU-8 模板。将Sylgard184 单体与引发剂按体积比10:1 混合均匀,导入SU-8 模板,将模板置于真空气缸内真空脱气。脱气后置于80 ℃烘箱固化1 h,自然冷却后将PDMS 从模板上剥离,剥离后在入口和出口处打孔。芯片顶层含有宽500 μm,高110 μm 蜿蜒形通道,通道中交错分布一系列用于捕获卵细胞的弧形筛网,筛网直径150 μm,由6 根直径35 μm 的微柱围成。芯片底层含有4 个平行的矩形通道,两端与共同的入口和出口连接。通道底面具有4*3 微柱阵列用于支撑PC 膜。PC 膜处理按照文献的方法,将PDMS 层等离子处理后与APTES 处理的PC 膜封接,步骤如下:淤将需要封接的PDMS 及PC 膜表面氧等离子处理1 min;于等离子处理后的PC 膜浸泡于5% APTES 溶液中20 min;盂将PC 膜取出,用蒸馏水冲洗3次,以去除表面未结合的APTES,氮气吹干薄膜;榆将PDMS与PC膜加压接触1 h,实现两者的有效封接。

 

 

图1 a. 芯片结构立体示意图; b. 芯片结构截面图说明芯片对于子宫结构的仿真;c. 芯片结构俯

视图及单个灌流培养单元放大图

生殖细胞和子宫内膜细胞的准备IVF 公鼠的选择、取精与精子处理 ,具体方法:选择8 周龄以上、体重大于25 g、雄性特征明显的公鼠,颈部脱臼致死, 剖开腹部取出附睾及输精管, 用小镊子挤压附睾尾部使精子挤入1 mL 平衡过夜的精子洗液滴中, 去掉附睾组织, 将此液滴置于37 ℃、5 % CO2、饱和湿度条件下培养20 ~25 min, 使精子自由浮动。精子获能操作参考精子洗液试剂盒说明书进行,具体方法:取10 μL 上述初步孵育、分散较好的活跃精子悬浮液加入到50 μL 平衡过夜的精子洗液滴中, 用血细胞计数器计算精子浓度并调整至2*105 ~5 *105个/ mL, 将此精子悬浮液置于37 ℃、5 % CO2 和饱和湿度条件下继续培养2 h。具体方法:选择6 周龄以上、体重大于20 g 的健康母鼠,每只母鼠腹腔注射10 IU PMSG, 间隔48 h 后再注射10 IU HCG, 间隔13 ~17 h 待用。将上述处理的母鼠于注射HCG 后13 ~17 h, 取其输卵管置于1 mL 卵细胞洗涤液中, 自输卵管壶腹部取出成熟卵冠丘复合体(Oocyteμcoronaμcumulus complex, OCCC),用0. 3 % 透明质酸酶溶液处理去除卵丘细胞, 再用50 μL 洗涤液冲洗4 次, 得到成熟裸卵。

 

小鼠子宫内膜细胞在培养瓶中进入指数生长期后收获并制成密度为2*105 / mL 的细胞悬液备用。

 

 

芯片实验操作

芯片和聚四氟乙烯毛细管在使用之前80 益烘烤1 h,微量注射器在75% 乙醇中浸泡6 h 后用灭菌蒸馏水冲3 次。使用前芯片、毛细管和注射器均置于紫外灯下照射,使用时在超净工作台上将芯片与注射器通过毛细管连接。明胶用灭菌双蒸水配制成0. 5% 的溶液。部分实验中使用CellTracker Green 标记小鼠子宫内膜细胞,以CellTracker Red 标记卵细胞。CellTracker 工作液使用二甲基亚砜新鲜配置。细胞标记步骤如下:淤收集细胞悬液后离心,吸取上清液,加入CellTracker 染液于细胞悬液中至终浓度10 μmol/ L,37益孵育30 min;于将细胞离心,弃上清后加入PBS 缓冲液,37 益孵育10 min;盂再次离心并加入PBS 缓冲液洗涤细胞,目的在于清除未结合染料。用CellTracker Green 标记细胞在荧光显微镜下观察时用蓝光激发观察,而CellTracker Red 标记细胞用绿光激发观察。

 

芯片操作步骤如图2 所示:

(a)芯片通道出入口1, 4 开放,2, 3 关闭。操作前先用0. 5% 明胶溶液灌注芯片通道2 min。微量注射泵抽取20 mL 子宫内膜细胞悬液从芯片进样通道缓慢注入,该步骤使子宫内膜细胞沉积在上层通道的卵细胞捕获区。排出剩余细胞悬液后芯片静置于培养箱中静置8 h 后,用齐氏实验室配制的子宫内膜培养基以10 μL/ h 流速灌流培养;

(b)培养小鼠子宫内膜上皮细胞24 h后,芯片通道出入口1, 2 开放,3, 4 关闭,以10 μL/ h 流速引入小鼠卵细胞悬液以将卵细胞其捕获于微网中;

(c)继而以10 μL/ h 流速向通道引入获能精子,保留6 h 完成受精;

(d) 芯片通道出入口3, 4开放,1,2 关闭,以10 μL/ h 速度持续灌流M16 胚胎培养液。实验期间每隔24 h 在倒置显微镜下观察芯片中胚胎的发育情况并拍照记录。

 

 

芯片上细胞共培养机制的建立

如图3 所示,在连接芯片出入口的4 路微量注射泵协同控制下,可以完成一系列细胞操作。首先利用多孔滤膜截留子宫内膜细胞,继而用微筛网捕获卵细胞。这样,卵细胞贴附于子宫内膜细胞层上,模拟了排卵过程。贴附有子宫内膜细胞的滤膜模拟子宫内膜结构,不仅对卵细胞起到支持、保护和营养作用,还可以通过细胞连接建立细胞之间的通讯。滤膜上的细胞藉由滤孔与底部的灌流培养液进行物质交换,模拟了体内细胞与毛细血管之间的物质交换形式。这种结合主动灌流与被动扩散的物质运输形式,不仅避免了流体剪切力对于细胞的伤害,而且还可以及时排除代谢产物,消除代谢物蓄积对细胞生长发育的不利影响。这种包含细胞μ细胞相互作用以及细胞μ外界物质交换作用的芯片共培养体系,有效模拟了子宫内部的微环境。

 

图3摇芯片操作步骤示意图(箭头表示液流方向)

 

芯片子宫内的受精及着床

卵细胞培养24 ~48 h 后,向芯片引入获能的小鼠精子模拟受精过程。少量精子接触卵细胞后与其结合,约6 h 后完成受精。受精后继续灌流培养,培养液一方面为受精卵不断补充新的营养物质,另一方面可以及时排除代谢废物。受精后约12 h 后能观察到小鼠精卵细胞结合。受精卵经过连续多次分裂之后在4 d 内形成桑椹胚(16 细胞),后者在芯片通道内继续分裂形成囊胚(32 细胞),大约在受精后6 ~8 d 进入子宫内膜层完成着床(见图4)。

 

图4摇连续观察芯片上受精卵细胞

芯片子宫与传统方法的比较

实验比较了芯片子宫与传统方法获得的2μ细胞率、4μ细胞率、桑椹胚率和囊胚率,这些指标可以动态地反映胚胎生成状况。在离体培养哺乳类动物(包括人)受精卵时发现,在一些化学成分确定的培养基中受精卵往往不能发育到囊胚,而是停顿在某个特定的发育时期,这种现象被称作“发育阻断冶。“发育阻断冶发生的具体机制尚不明了,分析可能是由于体外环境中存在不利于胚胎生成的因素。为了克服胚胎体外发育阻断,实验在芯片上采用卵细胞与子宫内膜细胞灌流共同培养方法,提供高度仿真的微环境以促进胚胎发育。

结果显示,培养皿组的2-细胞体,4-细胞体,桑椹胚以及囊胚数目分别为202,149,128 和73,而芯片组的对应数值为206,200,159 和122。芯片组受精卵各时期地发育情况均优于培养皿组(图5)。虽然两组的受精情况(2-细胞率)大致相当,但在胚胎逐渐发育的过程中体现出明显差异。结果表明,芯片组桑椹胚率和囊胚率明显高于培养皿对照组,以囊胚率的提高最为显著。相对于传统的培养皿方法,本研究发展的芯片子宫方法更有利于提高受精率及囊胚率与单纯的卵细胞培养相比,微流控芯片子宫更有利于体外小鼠胚胎发育。

 

分析其原因可能为:

(1)子宫内膜上皮细胞模拟体内子宫内环境,可分泌一些对早期胚胎发育有利的物质;

(2)子宫内膜上皮细胞可能通过与胚胎的相互作用促进其发育;

(3)所采用的灌流培养方法模拟了生理状态细胞与外界的物质交换形式,不仅为细胞提供充足的养分, 还可以及时清除对于胚胎发育不利的代谢产物。

综上所述,研究通过在微流控芯片上细致仿真子宫的结构和功能形成了一个类似于子宫的微环境。这种芯片子宫有利于卵细胞受精及受精后胚胎的生长发育,并能得到质量较好的胚胎。该技术除可应用于人类生殖医学工程,还可为深入研究胚胎发育机制及动物胚胎工程提供优质的胚胎,具有较为广阔的应用前景。

 

 

结论

发展了一种微流控芯片子宫,通过使用子宫内膜细胞-胚胎共培养以及连续灌流方式细致模拟子宫环境以促进胚胎生成。利用上述芯片子宫,完成了排卵、受精、着床以及胚胎发生等一系列实验过程。芯片子宫不仅操作简便,还可以获得较之传统方法更高的胚胎形成率。我们的后续实验会将芯片子宫发生的囊胚移植到动物子宫,直至发育成胎儿。

                 作者：李伟萱 李广铁  严伟 张琼 王维 周小棉 刘大渔