芯片杂交是DNA芯片技术中除DNA方阵构建外最重要的一步。杂交时选择的条件要使成千上万对的杂交反应中的最大多数处于最佳状态中，也就是说要使得尽可能多的正确配对物都不遗漏(假阴性尽可能少)，有错配的杂交降低至最低(假阳性尽量少)，这是非常难以达到的境界。
目前杂交是提高芯片在实际应用中的准确性的关键步骤之一。杂交条件的构建要根据芯片的实际情况进行最优化。
杂交反应是一个复杂的过程，受很多因素的影响，而杂交反应的质量和效率直接关系到检测结果的准确性。这些影响因素包括：(1)寡核苷酸探针密度的影响。 低覆盖率使杂交信号减弱，而过高的覆盖率会造成相邻探针之间的杂交干扰。(2)支持介质与杂交序列间的间隔序列长度的影响。研究表明当间隔序列长度提高到 15个寡核苷酸时杂交信号显著增强。有研究表明，选择合适长度的间隔序列，可使杂交信号增强150倍。(3)杂交序列长度的影响。在杂交反应中经常发生碱 基错配现象，区分正常配对的互补复合物与单个或2个碱基的错配形成的复合物，主要依赖于形成的复合物的稳定性不同，而杂交序列的长度是影响复合物稳定性的 一个重要因素，一般说来，短的杂交序列更容易区分碱基的错配，但复合物的稳定性要差一些;而长杂交序列形成的复合物稳定，而区分碱基错配能力要差一些。研 究表明，12、15、20个碱基产生的杂交信号强度接近，但15个碱基的杂交序列区分错配碱基效果最好。(4)GC含量的影响。GC含量不同的序列其复合 物的稳定性也不同。(5)探针浓度的影响。以凝胶为支持介质的芯片，提高了寡核苷酸的浓度，在胶内进行的杂交更象在液相中进行的杂交反应，这些因素提高了 对错配碱基的分辨率，同时也提高了芯片检测的灵敏度。(6)核酸二级结构的影响。在使用凝胶作为支持介质时，单链核酸越长，则样品进入凝胶单元的时间越 长，也就越容易形成链内二级结构从而影响其与芯片上探针的杂交，因而样品制备过程中，对核酸的片段化处理，不仅可提高杂交信号的强度，还可提高杂交速度。