建立了一种新的基于微流控液滴形成技术的聚乙烯醇(Poly(vinylalcohol)，PVA)微球制备方法。在微流控芯片上利用液滴形成技术可以快速、连续产生尺度均一、单分散性好的PVA液滴。液滴制备速度可以达到7个/s。并且通过改变制备液中两相流体的注入流量和微流控通道宽度可对生成的PVA液滴的尺寸进行调节。将收集得到的PVA液滴进行物理交联固化处理，可以获得大量尺寸均一的聚乙烯醇微球。本方法制备效率高，所得到的微球单分散效果好，而且微球形成不需要化学交联剂的掺入，避免了对包载物质的干扰，非常适合药物载体等应用。
1引言
药物载体是一种可以改变药物进入人体的方式、控制其在体内的分布和释放速度并将其输送到靶向器官的体系，很多新型的药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度，因而相关研究受到越来越广泛的关注。
现有药物载体的研究主要集中在微粒、脂质体、冻干粉、复乳及凝胶、纳米材料等新型输送系统。把药物溶解或者分散在高分子材料基质所形成的微小球状实体(微粒或微球)中就可以实现微粒载体的包载。包载药物的微粒通过特定表面修饰，在注入机体后，可对特定器官和组织起靶向识别作用。同时，微球中的药物的释放可以通过调控药物溶解度、物理状态、药物-微球亲和力等因素来调节，达到可控缓释等目的。其中，基于聚乙二醇-聚乳酸共聚物(PELA)、壳聚糖、海藻酸钠等材料的微粒药物载体由于制备难度较低、物化性质稳定、包封率和保护率较高等优点而得到广泛应用。但是，这些微粒载体制备方法仍存在有机溶媒残余量大、残留溶剂毒性大、工艺复杂、操作时间过长、药物稳定性易破坏等问题。因此，寻求新的药物微粒载体制备方法仍是该领域的研究热点。
相对于其它药物载体材料，聚乙烯醇(PVA)具有良好的生物相容性和亲水性，在生物体内能够缓慢降解;并且PVA材料无毒、价格低廉、来源丰富，因而在生物医学领域得到了广泛应用。基于PVA的微粒(微球)常被用作药物载体和血管栓塞剂。
目前，PVA微球制备常采用乳化交联、辐射交联和物理交联等方法。乳化交联是将作为分散相的PVA溶液与连续相混合，在一定温度下搅拌乳化一定时间后，再加入交联剂和催化剂搅拌，即可得到交联固化的PVA微球。该方法制作微球时，水相和油相混合搅拌乳化形成的PVA液滴大小不均，且尺寸很难控制，固化后得到的微球分散性差且形态也不规则。辐射交联是使用高能射线(如γ射线)对PVA溶液进行照射，进而实现固化的方法，这种方式实验条件相对较难，并且操作要求比较高。物理交联常采用分散相注射滴加的方式在大量溶液中形成PVA液滴，然后利用冷冻-解冻方法使PVA液滴固化形成微球。该方法形成的微球分散性较普通乳化交联法有了较大改善，而且也避免了交联剂和催化剂的残留。但是，这一方法所得到的微球通常尺寸较大(～1mm)，难以满足大多数的载药要求。
微流控液滴形成技术是近年来出现的微流控技术，可以在微流控通道内实现液滴生成和液滴操作。该技术需要被制备成液滴的分散相和连续相在通道内通过连续的相互作用生成液滴。微流控芯片上生成得到的液滴单分散性好，制备过程可实时观测分析，通过调节芯片液相的注入流量，可控制液滴的生成速率和大小。同时，通过设计通道结构和尺寸，也可以对液滴尺寸进行控制。本研究利用微流控液滴形成技术制备PVA液滴，所获得的PVA液滴不需要额外的收集过程即可进行物理交联固化，通过冷冻-解冻方法使PVA液滴固化获得凝胶微球。
2实验部分
2．1仪器与试剂
ＲDT高速摄像仪；AE31显微镜；B-95504微泵；101-233数显鼓风干燥箱；PDC-MG等离子清洗仪；DZF-6050真空干燥箱；HH2K2水浴锅。
司盘80；聚乙烯醇；二甲基硅油；聚二甲基硅氧烷。
2．2芯片设计及加工
使用AutoCAD制图软件绘制芯片的通道结构(图1A)，前端两条进样支路的夹角为135°，中间通道为不同曲折程度的蛇形通道，蛇形通道末端接长方形收集池结构。其中，进样支路和中间蛇形结构的通道宽度相同。
图1(A)芯片结构示意图;(B)制备的微流控芯片照片Fig．1(A)Diagramofchipstructure;(B)Photooffabricatedmicrofluidicchip的通道宽度相同。
采用软光刻工艺制备SU-8阳模。将适量PDMS前聚体与固化剂按10∶1的比例搅拌混合均匀，抽真空除去气泡，然后浇于培养皿内的模板上，厚度约为0．5cm。把培养皿水平放在75℃鼓风干燥箱内固化1h后取出。从模板上揭下固化的PDMS胶块，用打孔器在微通道进样孔的位置打通孔，用手术刀切出收集池。将PDMS和载玻片的待键合面朝上放入等离子清洗仪中清洗2min后取出，将处理后的两面键合在一起。在进出样孔上插入聚四氟乙烯导管，并用PDMS胶封合，再次于75℃固化，即可得到芯片(图1B)。将芯片置于显微镜观察平台，并将导管与微量注射泵连接，即完成实验系统的搭建。
2．3实验方法
2．3．1PVA溶液的配制
精密称取PVA-1799(聚合度1700，醇解度99%)2．5g，蒸馏水47．5g，加入到锥形瓶中90℃水浴3h，待PVA完全溶解后，即配制成质量分数为5%的PVA溶液。为了减少水浴过程中锥形瓶中的水分蒸发，锥形瓶用保鲜膜封口。
2．3．2连续相配制
将3mL表面活性剂Sapn-80加入到97mL二甲基硅油中，超声振荡，使Span-80完全溶解于硅油中，即得到表面活性剂体积分数为3%的连续相。
2．3．3液滴制备
在两个不同微量泵的注射器中分别吸取0．5mLPVA溶液和二甲基硅油，通过导管与浸润好芯片的分散相及连续相入口孔相连接。将芯片置于显微镜的载物台上(图2A)，调节两相液体的进样流量，观察并记录液滴的形成情况(图2B)。
2．3．4液滴的物理交联
待液滴稳定生成后，对芯片收集腔室收集到的液滴进行固化处理。将芯片置于!80℃冷冻12h再室温解冻8h，重复冷冻-解冻过程3次，即可得到固化的PVA微球。
3结果与讨论
3．1通道结构对PVA液滴形成的影响
3．1．1蛇形通道
液相从两侧支路汇入交叉口之后，当芯片后端不接蛇形通道时，单直通道形成的后端流阻较小，连续相对分散相的作用力表现为水平加速其向后端流动的效果，而垂直的剪切力不足以将分散相剪切成液柱或者液滴，由于连续相和分散相的油/水不溶，在通道内形成两相流的流动状态。随着后端弯折通道的增加(4弯折→8弯折→12弯折)，Y型交叉口位置形成的积压越来越大，连续相对分散相的剪切力也随之增大，分散相被剪切成的液柱逐渐变短至与通道宽度接近的尺寸。图3是在相同的芯片通道宽度，通道浸润时间和同一组进样速率条件下(分散相50#L/h，连续相100#L/h)，不同的蛇形通道长度(弯折通道数)的芯片在交叉口形成液滴的情况。
图2(A)实验系统装置;(B)液滴稳定生成Fig．2(A)Experimentalsystem;(B)Stableproductionofthedroplet
图3(A)0弯折通道形成两相流;(B)4弯折通道形成长液柱;(C)8弯折通道，液滴大小接近通道宽度;(D)12弯折通道，液滴大小接近通道宽度，但稳定时间较长Fig．3(A)0bendchanneltoformatwo-phaseflow;(B)4bendchannelstoformalongliquidcolumn;(C)8bendchannels，thesizeofdropletclosetochannelwidth;(D)12bendchannels，thedropletsizeclosetothechannelwidthforalongersettlingtime
芯片结构的后面部分设计成蛇形回路形状能够起到稳定通道内压力的作用，有利于在前方Y交叉口位置更均匀的形成液滴。蛇形通道同时也起到了延长液滴在通道内的流动时间的作用，使得生成的液滴的形态在长时间的流动过程中更加规则。同时，液滴在弯折蛇形通道内的流动，方便观察。
3．1．2通道宽度
微流控通道的宽度是影响液滴产生的一个重要因素，它限制了液滴的侧向扩展距离，从而决定了液滴稳定连续生成时的最小粒径尺寸。图4A和图4B中不同通道尺寸的芯片所生成的球形液滴，其直径与产生它们的通道宽度基本一致。调节分散相和连续相的进样流量，液滴稳定生成时的最小直径接近通道宽度，分别为(100．86±0．69)μm和(200．71±0．76)μm(n=7，下同)。
3．2流量对液滴形成的影响
在两相流体形成液滴的过程中，两相流不同的流动速度会对流体间的挤压、剪切过程产生影响，从而影响液滴的形成过程。在本研究中，分散相的进样流量设定为15#L/h，连续相设置为10、13、15和20μL/h，20#L/h后开始以10#L/h的梯度逐渐增加。以Y夹角交叉口作为1min内液滴生成数量的统计观察位置，使用高速摄像仪记录1min内不同连续相进样流量下生成液滴的数目情况，统计后计算得到单位时间内液滴的生成速率。生成液滴的长度(图5A)和生成速率(图5B)随着连续相流动速度的变化而改变。当连续相的进样流量为10μL/h时，连续相与分散相汇流时所产生的剪切力不足以切断分散相，从而无法形成液柱或液滴。增大连续相流量，当流速达到13μL/h时，通道内有长液柱形成，长度为(681．71±1．11)μm，单位时间内的液滴(柱)生成数量为(3．14±0．69)个。随着连续相流量的增大到15μL/h时，所形成液柱的平均液柱长度减小为(322．43±1．51)#m，但生成频率增大到(4．00±0．58)个/s。连续相的流量从20μL/h增加到90μL/h的8个进样流量下，液滴的长度不断减小，分别为(312．29±1．60)#m、(196．43±0．98)#m、(162．86±1．07)#m、(154．57±1．27)#m、(138．43±0．79)#m、(136．86±0．69)#m、(130．57±0．53)#m、(126．71±0．76)#m，单位时间内生成液滴的数量逐渐增加，分别为4．43±0．53、5．57±0．53、5．71±0．76、5．86±0．38、6．14±0．38、6．29±0．49、6．43±0．53、6．57±0．79。当连续相增大到100μL/h后，所形成液滴的长度在100#m(通道宽度)左右微小变化，分别为(106．86±0．69)#m、(100．29±0．76)#m、(98．43±0．53)#m、(101．57±0．79)#m、(100．29±0．49)#m、(97．14±0．69)#m、(98．00±1．00)#m，此时液滴生成速度保持在7个/s，然后急剧减少，分别为6．71±0．76、6．71±0．49、6．86±0．38、7．14±0．38、5．86±0．69、2．57±0．53、0．71±0．49。当连续相进样流量达到170μL/h时，通道内没有液滴生成。
图4(A)100μm通道宽度生成的液滴;(B)200μm通道宽度生成的液滴Fig．4(A)Dropletproducedinthechannelof100-μmwidth;(B)Dropletproducedinthechannelof200-μmwidth
图5(A)液滴长度随连续相变化情况;(B)液滴数量随连续相变化情况Fig．5(A)Lengthofdropletchangeswithcontinuousflowrate;(B)Numberofdropletchangeswithcontinuousflowrate
当分散相流量一定时，随着连续相流量的增大，连续相进样支路形成的积压压力也逐渐增大。这个压力形成的两个分力(对分散相的剪切力、推动液滴向前运动的动力)也随之增大。因此，在单位时间里连续相会截取得到更多，尺寸更小的液滴，同时向前的推动力也使液滴之间的距离增大。如继续增大连续相的流量，剪切力分压将会作用到分散相的进样支路上，从而使剪切得到的液滴数目下降，但所得到的液滴在通道内的运动速度会加快。而当剪切力分压大于分散相进样支路压力时，连续相进入分散相支路通道并阻碍分散相的流动，从而打破稳定生成液滴时的平衡状态。由于是恒流进样，受压迫支路内的压力不断累积，会再次和另一进样支路、蛇形通道形成稳定状态，而在这个稳定状态下，液滴的大小和生成速度较上一个稳定状态将发生改变。因此，当分散相的注入流量为15#L/h时，选择连续相流量为130μL/h时，可以得到较好的液滴形成效果，此时液滴制备速度可以达到7个/s。
3．3液滴的物理交联固化
微芯片中形成的PVA液滴经微通道最终会流进收集池中，当收集池中收集一定数目的液滴后，连同微芯片一起置于!80℃冷冻环境下进行快速冷冻。快速冷冻法可以有效降低冷冻过程中PVA液滴的形态变化程度，从而保证最终得到的微球的球形形态的规则性。PVA液滴经过一次冷冻/解冻过程得到的凝胶微球的强度较低，是一个轻度物理交联的过程，重复3次冷冻/解冻过程后的PVA凝胶微球达到了深度交联，凝胶微球的强度大大高于轻度交联的强度。随着交联程度深化，PVA聚合物的分子链间以及与水分子间的结合变得更加紧密，形成更多紧密的微晶区。单个PVA液滴宏观上的变化表现为体积的缩小，3次交联后的凝胶微球(图6)的平均直径为(84．12±1．64)μm，相比交联前的(100．86±200滋m
图6!80℃冷冻交联3次后的PVA凝胶微球的电镜图Fig．6ScanningelectronmicroscopyimageofPVAgelmicrospheresafterthricefreezingcrosslinkingat!80℃0．69)μm(分散相15μL/h，连续相100μL/h)，直径缩减了16．60%。
其它常用的PVA交联固化法包括化学乳化法和辐射法。本研究采用物理交联固化的方法，与乳化交联法相比，由于未引入任何有毒的化学试剂，得到的PVA微球更加安全、可靠，有利于后期应用该载体开展靶向给药、定点缓释等领域的应用研究;相比于辐射交联法，冷冻/解冻的物理交联法操作简便易行。
4结论
各种高聚物微球在药物载体等领域得到了越来越广泛的应用。相对于其他高聚物材料，聚乙烯醇在微球制备及应用方面具有独特优势。传统制备方法得到的PVA微球的单分散性不佳，产率也较低，限制了这一材料的广泛应用。
本研究采用微流控液滴制备技术连续产生大量尺寸均一的PVA液滴，通过物理交联固化产生PVA微球。结果表明，通过使用不同通道宽度的芯片或者改变连续相和分散相的注入流量可以得到不同大小的PVA液滴。本方法制备得到的PVA微球单分散性效果好;同时，可根据需要调节微流控芯片内流动参数制备不同粒径大小的PVA微球，并允许对制备过程实时观测分析和调整。有助于参数优化和液滴制备效果的改善，相对于传统大容积制备器皿，芯片的表面/容积比更大，加热和降温都更快，更有利于PVA液滴的物理交联，芯片内所集成的收集腔室等微结构能够富集微球，有利于收集等操作。
文献来源分析化学 DOI: 10．11895 /j．issn．0253-3820．181156 作者：韩县伟 张洪武 罗洪艳等（转载仅供参考学习及传递有用信息，部分内容有删减，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除）